Factores Neurotróficos en Neurobiología Celular y Regeneración:

Las neuronas son la unidad funcional del sistema nervioso (SN) y tienen una morfología especializada para formar redes neuronales que determinan las funciones mentales superiores y regulan la fisiología de los organismos. Para cumplir esta labor las neuronas reciben  contactos sinápticos en su árbol dendrítico  y traducen esta información a través del axón a otras neuronas

Figura 1. Neurona hipocampal en cultivo. Se observan prolongaciones originadas desde el cuerpo celular (dendritas) que han sido inmunoteñidas con un marcador somatodendrítico (amarillo).  En rojo se ha dibujado el largo que tendría el axón de la neurona hipocampal madura (más de 100 veces el diámetro del cuerpo celular). Oscar M. Lazo.

El axón es una prolongación neuronal, cuyo largo es varias veces el diámetro del cuerpo celular. Otorga a la neurona una morfología especial (Figura 1), pero al mismo tiempo impone un desafío para la comunicación intracelular y tráfico de vesículas. Por ejemplo, señales que son recibidas en el terminal axonal y deben viajar retrógradamente hasta el cuerpo celular para regular la expresión de genes (Figura 2 y Figura 3). La relevancia que tiene del tráfico vesicular en neuronas se ve reflejada en que numerosas enfermedades neurodegenerativas presentan alteraciones en los mecanismos que gobiernan el tráfico de vesículas y de complejos macromoleculares (Bronfman FC, et al 2007).

Las neurotrofinas (NGF, BDNF, NT3, NT4) son proteínas solubles producidas por las neuronas y sus blancos en forma autocrina y paracrina. Las neurotrofinas aumentan la comunicación efectiva entre las neuronas mediante la inducción de cambios plásticos en ellas. Un incremento de los niveles de estas proteínas por regulación hormonal, ejercicio o un daño al SN está asociado con un aumento de la sobrevida neuronal y reparación funcional luego de daño al sistema nervioso o en patologías donde ocurre neurodegeneración.

Figura 2. Un ejemplo fisiológico de transporte retrógrado de señales neurotróficas es la ruta septo-hipocampal. Las neuronas colinérgicas ubicadas en el septum basal (MS) proyectan axones al hipocampo (HC) a través de la Fimbria-Fornix. El NGF (círculos azules) es secretado en el hipocampo y regula la expresión de marcadores del fenotipo en la neuronas colinérgicas del MS mostradas en naranjo (Lazo OM, et al 2010).
El diagrama muestra una representación tridimensional de un cerebro murino.

Figura 3.Las neurotrofinas () se unen a los  receptores  Trks () y al receptor de neurotrofinas p75 () generándose endosomas de señalización que van al cuerpo celular. El transporte de este organelo es llevado a cabo por el motor molecular dineína.

Regulación de la señalización mediada por neurotrofinas

Las neurotrofinas llevan a cabo su función uniendo específicamente a un tipo de receptor de tirosina quinasa de la familia Trk (NGF/TrkA, BDNF/TrkB, NT3/TrkC) y al receptor de neurotrofinas p75 (p75). A diferencia de los Trks, p75 interactúa con diferentes co-receptores de membrana y ligandos, induciendo muerte celular o inhibición del crecimiento axonal (Fainzilber M, & Bronfman FC, 2004). Entre los procesos que regulan la señalización neurotrófica están la proteólisis, la internalización y la dinámica intracelular de los receptores luego de su activación en la superficie neuronal (Bronfman FC, 2007). Nuestro interés científico es entender los mecanismos celulares implicados en la regulación de la señalización neurotrófica en diferentes modelos neuronales in vitro e in vivo.

Tópicos de Investigación

Estudio de la función de la internalización, transporte intracelular y proteólisis de los receptores de neurotrofinas en la señalización neurotrófica en diferentes modelos neuronales normales y neuropatológicos.

Estamos usando diferentes herramientas para inhibir o alterar la internalización, tráfico y la proteólisis de los receptores. Estas incluyen ARN de interferencia y mutantes dominantes negativos o constitutivamente activos de; (i) Rab GTPasas que regulan el tráfico de vesículas (Figura 4), (ii) adaptadores intracelulares que regulan la internalización de los receptores, y (iii) proteasas que regulan el procesamiento proteolítico de receptores de membrana.

Figura 4. El tráfico endocítico de los receptores es importante para su señalización, puesto que en endosomas pueden seguir señalizando de una manera diferente que desde la membrana plasmática. La capacidad de reciclaje del receptor amplifica la señal y determina la disponibilidad de éste en la membrana. Finalmente, la destinación a lisosomas (L) induce la degradación del receptor y por lo tanto, limita el tiempo de señalización. Las GTPasas monoméricas de la familia Rab regulan el tráfico de receptores. Rab5 regula la fusión de vesículas y la generación del endosoma temprano (EE), Rab7 induce la maduración del endosoma temprano a endosoma tardío (LE) y generación de lisosomas en la ruta endocítica. Desde endosomas tempranos los receptores puden ser destinados al endosoma de reciclaje (RE) y de ahí pueden volver a la membrana plasmática, proceso que es regulado por Rab11.

Un ejemplo de un proceso celular donde la señalización, proteólisis e internalización de un receptor están coordinados, es la dinámica celular del receptor de neurotrofinas p75. El receptor p75 se internaliza y es sujeto de proteólisis; primero, p75 es procesado por una metaloproteasa en su dominio extracelular y luego por la gamma-secretasa, generando un fragmento intracelular con capacidades de señalización (Bronfman et al 2003; Bronfman 2007). Nosotros reportamos que la activación de TrkA, el receptor de NGF, regula el primer evento proteolítico de p75 y que el segundo evento ocurre en endosomas (Urra S, et al 2007). Ahora estamos estudiando la función de estos procesos en neuronas simpáticas del sistema nervioso autonómico (Figura 5), donde p75 induce muerte celular mediante la activación de la MAPK regulada por estrés celular, denominada c-Jun NH2-terminal kinase (JNK). Nuestros datos muestran que la JNK induce la internalización y transporte retrógrado de la señal apoptótica del receptor de neurotrofinas p75 (Claudia Escudero, tesis de doctorado en curso).

Figura 5. Las neuronas simpáticas del ganglio cervical superior cultivadas in vitro. La internalización del receptor de neurotrofinas p75 puede ser estudiada gracias a un anticuerpo contra el dominio extracelular del receptor (MC192). El p75 internalizado se ve en verde y el que está asociado a la superficie neuronal se observa en rojo. En azul está marcada una proteína asociada al citoesqueleto llamada MAP1B. Foto. Claudia Escudero.

Otro modelo de estudio que usamos son las neuronas hipocampales (Figura 6). En ellas estamos estudiando el rol de la internalización y tráfico de los receptores de BDNF en la plasticidad estructural inducida por BDNF. Los resultados de nuestro laboratorio muestran que la GTPasa monomérica Rab11, que regula la dinámica del endosoma de reciclaje, podría tener un rol importante coordinando los eventos celulares que resultan en el incremento del árbol dendrítico mediada por las neurotrofinas (Oscar Lazo, Tesis de Doctorado, paper en preparación).

Figura 6. Las neuronas del hipocampo de una rata pueden ser cultivadas in vitro. En la figura se observa una neurona hipocampal de 7 días de cultivo teñida para una proteina asociada al citoesqueleto llamada MAP2. Esta proteína solo se localiza en el cuerpo celular y en las dendritas.
Por esta razón , MAP2, se usa como un marcador del “árbol dendrítico” de una neurona. Los puntos de ramificación del árbol pueden ser estudiados mediante el análisis de Sholl, al contar las veces que una prolongación cruza los círculos concéntricos como se indica en el recuadro de abajo. Foto. Oscar M. Lazo


Una enfermedad neurodegenerativa que muestra una alteración en el sistema endosomal, producto de una acumulación de colesterol, es la enfermedad de Niemann Pick tipo C. Hemos usados modelos celulares y animales para estudiar el efecto de estas alteraciones endosomales en la señalización neurotrófica.  (Figura 7). Encontramos que existe una regulación positiva de la señalización neurotrófica en esta enfermedad sugiriendo que una regulación anómala de la señalización neurotrófica podría llevar a neurodegeneración (Carolina Cabeza y cols., paper en revisión).

Figura 7. La línea celular PC12 puede ser diferenciada a una célula tipo neuronal con NGF. En la foto se muestra células PC12 diferenciadas 3 días con NGF y tratadas con una droga que induce el fenotipo celular de la enfermedad de Niemamm Pick tipo C. En azul se observa organelos endosomales llenos de colesterol. En rojo se observa el citoesqueleto de actina. Foto. Carolina Cabeza.

Nosotros pensamos que nuestros resultados son un avance en el entendimiento respecto a las relaciones funcionales que existen entre señalización y tráfico durante los diferentes eventos celulares regulados por neurotrofinas y otros factores de crecimiento del sistema nervioso.

Estudio de los mecanismos moleculares que subyacen la regeneración axonal y plasticidad luego de daño al SN favorecida por factores neurotróficos.

La isquemia (disminución del suministro de oxígeno y glucosa a una región del cerebro) subyace diferentes condiciones neuropatológicas como el infarto cerebral, el trauma al SN y daño a la médula espinal. Por esta razón, estamos empezando a estudiar el mecanismo de regeneración de axones que han sufrido axotomía o daño isquémico. Para llevar a cabo este objetivo estamos estableciendo cultivos donde el árbol dendrítico crece en una cámara de cultivo separada de los axones (Figura 8). Este modelo permite medir tanto eventos tempranos como tardíos en el proceso de regeneración axonal luego de axotomía o daño al axón.

Figura 8. En el cuadro de la izquierda se muestra un cultivo compartimentalizado de neuronas hipocampales de 15 días en cultivo. El cultivo compartimentalizado, tiene 3 compartimentos diferentes; el de los cuerpos celulares (CC), los microsurcos (MS) y el compartimento axonal (CA). En rojo se muestran los axones de las neuronas marcadas con una tinción vital (calceina) desde el CA. En el CC solo se marcan las neuronas que están “compartimentalizadas”, es decir, aquellas cuyo axón cruzó por los microsurcos y llegó al CA. En el recuadro de la derecha se muestra un cultivo similar al de la izquierda antes (A) y después (B) de que las neuronas han sido axotomizadas con una pipeta

También hemos establecido un modelo de infarto cerebral en ratas para estudiar los mecanismos que gobiernan los cambios plásticos inducidos por factores neurotróficos (Figura 9). En este momento tenemos proyectos enfocados en estudiar el rol de neuromoduladores en la recuperación funcional luego de isquemia focal. Además, estamos probando drogas botánicas que son potencialmente neuroprotectoras o inductoras de plasticidad neuronal.

Para modelar un infarto focal hemos montado un modelo en rata donde inducimos el infarto por inyección estereotáxica de un vasoconstrictor llamado endotelina-1. En los paneles de arriba se muestran cortes coronales de un cerebro de rata marcados con una tinción vital. En los recuadros de abajo se muestra con las flechas el lugar donde ocurrio el infarto y por lo tanto, hay tejido nervioso muerto.

Esperamos avanzar en los requerimientos celulares necesarios para la regeneración y plasticidad de neuronas dañadas. Estos estudios contribuirán al conocimiento básico de la regeneración neuronal y generarán nuevas claves que ayudarán a crear oportunidades para nuevas intervenciones terapeúticas en diferentes situaciones de daño al SN.

Bibliografía

- Bronfman FC. Metalloproteases and γ-Secretase: New Membrane Partners Regulating p75 Neurotrophin Receptor Signaling? J. Neurochem. 103 (Suppl1) 91-104 2007.

- Bronfman FC, Escudero CA, Weis J, Kruttgen A. Endosomal transport of neurotrophins: roles in signaling and neurodegenerative diseases Dev Neurobiol 67(9) 1183-203 2007.

- Bronfman FC & Fanzilber M. Multi-Tasking by the p75 neurotrophin receptor Sortilin things out? EMBO Reports. 5 867-871 2004.

- Bronfman FC, Tcherpakox M, Jovin T, Fainzilver M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. J. Neurosci. 23(8) 3209-3220 2003.

- Oscar M Lazo, Jocelyn C Mauna, Claudia A Pissani, Nibaldo C Inestrosa, Francisca C Bronfman. Axotomy induced neurotrophic withdrawal causes the loss of phenotypic differentiation and downregulation of neurotrophic signaling, but not death of septal cholinergic neurons. Mol Neurodegener. 5: 5. 2010

- Urra S, EscuderoCA, Ramos P, Lisbona F, Allende E, Covarrubias P, Parraguez JI, Zampieri N, Chao MV, Annaert W, Bronfman FC. Membrane bound carboxyterminal fragments of p75 neurotrophin receptor are generated by the activation of TrkA and internalized to endosomes for γ-secretase mediated processing. J. Biol Chem 282 (10) 7606-1, 2007.


Diseño Savant